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BM0403 EHA101电转感受态细胞
BM0404 GV3101(pSoup)感受态细胞
BM0405 GV3101(pSoup)电转感受态细胞
BM0406 GV3101(pSoup-p19)感受态细胞
BM0407 GV3101(pSoup-p19)电转感受态细胞
BM0408 EHA105(pSoup)感受态细胞
BM0409 AGL1(pSoup)感受态细胞
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BM0411 Ar A4感受态细胞
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BM0413 Ar Qual感受态细胞
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BM0415 MSU440感受态细胞
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BM0429 Y190感受态细胞
Y190感受态细胞家具阐明
基因型
MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, cyhr2, LYS2 : : GAL1
UAS-HIS3TATA-HIS3, MEL1 URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ
● 家具阐明
Y190 菌株是 Clontech 公司竖立的 GAL4 系统酵母双杂执行用菌株,MATa 型,可平直更正质粒或与 MATα 型酵母菌株 Y187通过 mating 操作进行卵白互作考据或筛库闇练。Transformation marker 为:trp1,leu2,cyh2;阐明注解基因为:lacZ,HIS3,MEL1。Y190-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:(pGB 和 pACT2)或(pGBKT7 和 pGADT7)。质粒 pGB 由 pGBKT7修订而来,筛选璀璨为 TRP1,用于抒发 DNA-BD(来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~ 174 位氨基酸)与指标卵白(Bait)的交融卵白;质粒 ACT2 与 pGADT7 的结构和功能相似,筛选璀璨为 LEU,用于抒发 AD(GAL4 C 端 768~881 位氨基酸)与指标卵白(Prey)的交融卵白。GAL4 系统旨趣:一个完好的酵母转录因子 AL4 可分为功能上互相寂寞的两个结构域:位于 N 端 1~174位氨基酸区段的 DNA 集结域 (DNA-BD)和位于 C 端 768~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD 大略识别 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS,并与之集结。而 AD 不错运转 UAS 下流的基因进行转录。BD 和 AD 单独存在不成激活转录,但当二者接近时,则呈现完好的 GAL4 活性,使含有 UAS 的运转子下流基因转录抒发。过去要求下,BD 不与 AD 集结,将要检测的卵白质分散与 BD 和 AD 交融,酿成 bait 交融卵白(bait –BD)和 prey 交融卵白 (prey-AD),如若 bait 和 prey发生互相作用,就会促使 BD 和 AD 的互联贯近,酿成完好的 GAL4,从而激活阐明注解基因的转录。Y190 感受态细胞经特等工艺制作,-80℃可保存三个月,pGADT7 质粒检测更正成果>104 cfu/μg DNA。
● 操作步伐
1. Carrier DNA 在每次使用前要通过加热措置使其变性为单链气象,轨范如下:Carrier DNA 放 95℃水浴或金属浴 3 min,快速插入冰中,静置 3 min,再次放 95℃水浴或金属浴 3 min,快速插入冰中,静置 3 min 以上。
2. 取 100 µl 冰上溶解的 Y190 感受态细胞,循序加入预冷的看法质粒 0.5-3 µg,Carrier DNA10 µl,PEG/LiAc 500 µl 并吸打几次混匀,30℃水浴 30 min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。
3. 将管放 42℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。
五月色播4. 5000 rpm 离心 40 s 弃上清,ddH2O 400 µl 重悬,离心 30s 弃上清。
5. ddH2O 50 µl 重悬反差 眼镜,涂板,29℃培养 48-96 h。